Лабораторная работа 1.1. Анализ белков при помощи электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (SDS-PAGE)

Видео

Лекция

1.1. Теоретические предпосылки 

1.1.1. Сущность электрофоретического разделения биологических макромолекул


В основе метода электрофореза лежит явление миграции заряженных частиц под действием электрического поля. Многие биологические микро- и макромолекулы, такие как пептиды, белки, нуклеиновые кислоты, обладают ионизируемыми группами и при определенном значении рН окружающей среды существуют в растворе в виде положительно заряженных частиц – катионов, либо в виде отрицательно заряженных частиц – анионов. Следовательно, под влиянием внешнего приложенного электрического поля эти заряженные частицы будут мигрировать либо к катоду, либо к аноду, в зависимости от своего результирующего заряда и молекулярной массы.

Метод электрофореза, предложенный еще в начале ХХ века, сейчас широко используют в биологии и медицине для разделения белков в исследовательских и клинических целях. С помощью электрофореза можно разделить на отдельные компоненты белковую смесь, что позволяет установить молекулярную массу белка или его субъединиц, подтвердить чистоту выделенного белка. Таким образом, электрофоретический метод в биохимии – это способ пространственного разделения молекул в плотном пористом геле, имеющих разный заряд и размеры. Результатом проведения электрофореза является электрофореграмма - изображение, полученное после разделения сложной смеси с помощью электрофореза и специфического проявления (окрашивания).

Электрофореграммы белков различных биологических жидкостей человека (сыворотка крови, моча, спинномозговая жидкость и др.) позволяют врачам и медицинским биохимикам получить значительную диагностическую информацию. Результаты электрофоретического разделения ферментов (зимограммы) позволяют изучать изменения активности и изоферментного спектра таких белков под действием внешних и внутренних факторов, как у человека, так и у других организмов (рис. 1).

Обычно белки находятся в растворе в виде заряженных частиц. Заряд на поверхности белков возникает в результате диссоциации группировок, находящихся в боковых радикалах аминокислот (карбоксильных, амино-, имидазольных и др. групп), а также при связывании ионов. Так как степень диссоциации группировок зависит от рН раствора, то величина и знак суммарного заряда белковой молекулы зависят от рН среды, а также от ионной силы (интенсивности электрического поля, создаваемого ионами в растворе).


Рисунок 1 - Результаты электрофореза 7 образцов белков в полиакриламидном геле (ПААГ). После разделения белков, гель погружался в раствор красителя – Coomasie R250, который связывается с молекулами белков. Изображение (электрофореграмма) было получено сканированием окрашенного геля.

Для каждого белка существует такое значение рН среды (обозначаемое как рI – изоэлектрическая точка), при котором положительные и отрицательные заряды ионизированных групп будут скомпенсированы. Вследствие этого факта, заряд всей белковой молекулы равен нулю. Таким образом, в буферном растворе со значением рН = рI изучаемого белка, невозможно движение белковой молекулы в приложенном электрическом поле.

Из-за разницы в аминокислотном составе, все белки имеют разные значения рI. При рН ≠ pI молекулы белка приобретают заряд и под действием электрического поля перемещаются к противоположно заряженным электродам – катоду(‑) или аноду(+). Например, кислые белки, богатые моноаминодикарбоновыми аминокислотами (аспарагиновая кислота (Asp); глютаминовая кислота (Glu), даже в буферном растворе со слабощелочным значением рН (8.0 – 8.5) приобретут значительный суммарный отрицательный заряд, вследствие диссоциации карбоксильных групп на СОО‑ и H+ и будут двигаться к аноду.

Для электрофоретического разделения биологических макромолекул оптимально такое значение рН рабочего буферного раствора, которое обусловливает максимальное различие зарядов разных белков, составляющих исходную смесь, а не их максимальный заряд. Обычно электрофорез проводят в среде (буфере) со значением рН, на 3 — 4 единицы отличающимся от среднего значения рI для белков данного типа. Это позволяет добиться хорошей электрофоретической подвижности и, вместе с тем, сохранить ощутимые различия молекул по заряду. Предпочтительно использовать буфер известной и постоянной ионной силы на основе однозарядных ионов. От рабочего буфера также требуется существенная емкость, так как локальная концентрация белка в образующихся при разделении смеси зонах скопления молекул может оказаться значительной. Поэтому используют буферы с концентрацией не менее 0.1 — 0.2 М. При проведении электрофореза электрическое поле создают с помощью источника питания – стабилизированного выпрямителя, способного давать регулируемое напряжение до 100 – 1000 В, при силе тока в несколько десятков миллиампер (мА).

Электрофорез проводят в однородном электрическом поле, то есть в поле, напряженность E которого во всех точках одинакова. Электрический ток пропускают через проводник – буферный раствор, налитый в канал из изолирующего материала (например, стекла) или пропитывающий какую-либо поддерживающую среду – носитель (например, бумагу или гель). Сопротивление R буферного раствора задается двумя факторами: концентрацией в нем свободных ионов и их электрофоретической подвижностью. Электрофоретической подвижностью (u) данной молекулы называют скорость движения заряженной молекулы (выражаемой в см/ч) в электрическом поле с напряженностью 1 В/см. Именно различия в электрофоретической подвижности белков, содержащихся в анализируемой смеси, делают возможным разделить эти белки в пространстве (в разных зонах электрофореграммы).

Скорость V движения белков к тому или иному электроду снижается из-за их трения в окружающей среде. Сила трения прямо пропорциональна скорости движения белковых молекул. Коэффициент трения белковой молекулы, обозначенный как f, зависит как от размера, формы и степени гидратированности этой молекулы, так и от свойств самой среды. Электрофоретическая подвижность белка зависит:

  • от самой молекулы: ее размера (молекулярной массы), формы, электрического заряда, степени диссоциации и гидратации,
  • от концентрации молекул,
  • от свойств среды: ее вязкости, рН, температуры и ионной силы,
  • от характеристик используемого электрического поля (для крупных макромолекул применяется электрофорез в пульсирующем электрическом поле).

 

1.1.2. Классификация электрофоретических методов:

Основными типами электрофореза являются:

  • зональный электрофорез,
  • изотахофорез,
  • изоэлектрическое фокусирование,
  • иммуноэлектрофорез.

Зональный электрофорез проводится при постоянном (не изменяющемся) значении рН буферного раствора, заполняющего данный носитель (бумагу, гель, др.). Исследуемый образец наносится пятном или тонким слоем на носитель, по которому и перемещается в электрическом поле. Усложненным вариантом зонального электрофореза является диск-электрофорез (многофазный зональный электрофорез), при котором рН и другие характеристики, постоянные внутри одной “фазы”, при переходе к другой “фазе” скачкообразно изменяются.

При изоэлектрическом фокусировании в среде для электрофореза создается плавный градиент рН. Белок останавливается в зоне, где значение рН равно его изоэлектрической точке (pI). Для создания градиента рН обычно используют раствор полиамино-поликарбоновых кислот, которыми насыщают носитель. В отсутствии электрического поля эта смесь обычно имеет значение рН равное 6.5. При наложении электрического поля указанные кислоты обеспечивают линейный градиент рН от 3 до 10.

В случае изотахофореза заряженные ионы сначала разделяются в соответствии с величинами их заряда и подвижности, а затем перемещаются в электрическом поле с одинаковыми и постоянными скоростями.

Иммуноэлектрофорез сочетает в себе электрофоретическое разделение белков с иммунопреципитацией, основанной на реакции “антиген – антитело”. Этот тип электрофореза превосходит остальные по чувствительности и разрешающей способности.

По цели применения электрофореза различают:

  • аналитический электрофорез (для анализа состава смеси),
  • препаративный электрофорез (для получения препаратов - значительных количеств чистых веществ).

По степени денатурации разделяемых белков различают:

  • нативный электрофорез,
  • электрофорез в денатурирующих условиях.

В отличие от нативного электрофореза, электрофорез в денатурирующих условиях предполагает применение химических реагентов, разрушающих пространственную структуру разделяемых белков и экранирующих собственный заряд молекулы.

По направлению фракционирования различают:

  • одномерный (1D) электрофорез, при котором белки движутся в одном направлении (горизонтальный или вертикальный электрофорез);
  • двумерный (2D) электрофорез, при котором сначала проводят разделение в одном направлении, а затем – в направлении, перпендикулярном первому. Двумерный электрофорез позволяет резко увеличить разрешающую способность при разделении смесей, состоящих из большого количества разных белков. В зависимости от ориентации носителя (геля, бумаги, др.) электрофорез также может быть вертикальным или горизонтальным;
  • электрофорез в объеме (3D). Один из наиболее точных аналитических методов, применяемых для анализа белков и нуклеиновых кислот. Носитель находится внутри стеклянного сосуда (колонки). Примером такого способа служит капиллярный зональный электрофорез – метод разделения молекул по заряду и размеру в тонком капилляре, заполненном электролитом. Для проведения капиллярного электрофореза требуется относительно простое оборудование. Основные компоненты системы: флакон для нанесения образца, стартовый флакон, конечный флакон, капилляр, электроды, мощный источник питания, детектор и устройство обработки данных. Флакон для нанесения образца, стартовый и конечный флаконы заполнены электролитом, например, водным буферным раствором. Для нанесения образца конец капилляра опускают во флакон с образцом и затем перемещают в стартовый флакон. Миграция молекул анализируемых веществ осуществляется под действием электрического поля, которое прилагается между стартовым и конечным флаконами. Ионы передвигаются по капилляру в одном направлении под действием электроосмотического тока. Анализируемые вещества разделяются по электрофоретической мобильности и детектируются около конца капилляра. Эффективность разделения путем капиллярного электрофореза значительно выше, чем эффективность других методов разделения, например, высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). В отличие от ВЭЖХ, в случае капиллярного электрофореза не происходит массообмена между фазами. Профиль потока для систем электроосмотического потока является плоским, в противовес ламинарному профилю хроматографических колонок, в которых разделение происходит под давлением. В результате этого при электроосмотическом разделении не происходит расширения полос, как при хроматографии. Разделение капиллярным электрофорезом может иметь несколько сотен тысяч теоретических тарелок. Еще сильнее повысить разрешающую способность электрофореза помогает комбинирование различных типов, например, иммуноэлектрофорез в вариации капиллярного зонального электрофореза.

На сегодняшний день, в целях обеспечения высокого качества фармацевтических и биофармацевтических субстанций, принято использовать так называемые «системы для электрофореза». Это оборудование, позволяющее производить быстрый, точный и качественный анализ препаратов различными методами электрофоретического разделения. Программное обеспечение данных систем позволяет подобрать оптимальный метод и грамотно проанализировать полученные результаты.


Рисунок 2 - Система фармацевтического анализа «PA 800 plus» от «Beckman Coulter» позволяет проводить высокоточные качественные и количественные исследования биофармацевтических субстанций с высокой производительностью. Предел детекции: 10 ‑18 – 10‑21 моль. Обеспечивает лабораторию следующими методами контроля: электрофорез белков в денатурирующих условиях с додецилсульфатом натрия (SDS) высокого разрешения для разделения белковых примесей и определения чистоты лекарственной субстанции; автоматический анализ чистоты препаратов рекомбинантных моноклональных антител IgG (иммуноэлектрофорез высокого разрешения), капиллярное электрофоретическое изофокусирование для анализа гетерогенности белковой лекарственной субстанции; изучение профиля гликозилирования молекул для определения микрогетерогенности белковой лекарственной субстанции.

1.1.3. Носители, применяемые для проведения электрофореза

Рассматривая историю появления метода электрофореза, можно отметить, что впервые электрофорез был применен без какого-либо носителя: электрическая цепь между электродами замыкалась через буферный раствор, в котором и происходило разделение белков. Позднее при электрофорезе начали применять носители жидкой фазы – полимеры, служащие “каркасом” для буферного раствора. Применение носителей позволило заметно снизить конвекцию (перемешивание) и, следовательно, повысить качество разделения белков. Носитель может быть в форме порошка, пленки, геля и др. Последующие разработки были посвящены усовершенствованию свойств носителей.

Идеальный носитель должен:

  • резко снижать конвекцию;
  • быть простым в приготовлении;
  • иметь высокую теплопроводность (при низкой теплопроводности трудно охлаждать систему);
  • обладать низкой адсорбционной емкостью и химической инертностью в отношении веществ, подвергаемых электрофорезу;
  • быть электронейтральным (не иметь заряда на поверхности), чтобы не вызывать эндоэлектроосмос. Если разделяемые белки заряжены отрицательно, то при электрофорезе они должны двигаться к аноду (+), однако, эндоэлектроосмос будет “тянуть” их в другую сторону, к катоду (‑), мешая электрофоретическому разделению.

Гели легко принимают разные геометрические формы, поэтому в названии электрофоретического метода с их использованием указывают, какова конфигурация рабочего пространства.

Гель для электрофореза можно заполимеризовать:

  • в трубках,
  • в капиллярах,
  • в пластинах (“слэбах” – от англ. slab),

Основной недостаток электрофореза в трубках - это отсутствие теплооттока: температура в центре цилиндра геля оказывается выше, чем у его прилегающей к стеклу поверхности. Это приводит к изгибу белковых зон. На одну трубку наносится одна исследуемая проба. Повысить теплоотток можно, применяя очень тонкие трубки - капилляры. В тонких пластинах также достигается гораздо более эффективное отведение тепла, чем в трубках. Кроме того, конфигурация пластины позволяет в абсолютно идентичных условиях проводить разделение сразу нескольких проб. Пластины легко сканировать и удобно разрезать. По сравнению с цилиндрическими гелями, пластины позволяют значительно уменьшить концентрацию белка в наносимой пробе.

Таблица 1 - Преимущества и недостатки использования различных носителей при электрофорезе

Название метода, носитель

Преимущества метода и/или носителя

Недостатки

Электрофорез с подвижной границей (в свободном растворе). Носителя нет.

Первый электрофоретический метод, позволивший разделять белки

Сложно избежать конвекции – перемешивания разделяемых зон; для исследования нужна проба в десятки мг белка; разрешающая способность мала (не более 8 компонентов в пробе).

На фильтровальной или хроматографической бумаге (50-е годы XX в.)

Сниженная конвекция, разделенные зоны можно зафиксировать и окрасить. Оборудование проще.

Непрозрачность. Загрязнения и неоднородность бумаги мешают разделению. “Хвосты” на электрофореграммах из-за высокой адсорбционной емкости. Фон окрашивается, что затрудняет распознавание белковых зон.

На пленках из ацетата целлюлозы (известен с 1957г.)

Быстрый, требует меньшего количества пробы для анализа. Низкая адсорбционная емкость помогает избежать появления “хвостов” на электрофореграмме. После окрашивания фон остается бесцветным. Пригодны для иммуноэлектрофореза.

Непрозрачность в водных растворах (можно добиться прозрачности, погрузив в минеральное масло). Дороже, чем при использовании бумаги. Мало пригоден для препаративного электрофореза.

В крахмальном геле (предложен О. Смитисом)

Первый носитель со свойствами молекулярного сита. Активно препятствует конвекции. Повышает разрешение.

Низкая прозрачность, хрупкость, размер пор можно менять лишь в небольших пределах. Приготовление качественного геля трудоемко.

В агаровых и агарозных гелях

Удовлетворительная прозрачность, высокая пластичность (проще резать, удобнее красить и определять ферментативную активность прямо в геле), простота изготовления.

Из-за отрицательного заряда на сульфатных и СООН-группах сетки агара возникает электроосмос, приводящий к неравномерному распределению электрического поля, а иногда – гидростатического давления. Возможно химическое взаимодействие веществ с агаром.

В полиакриламидном (ПААГ) геле (предложен Л. Орнстейном и Д. Дэвисом)

Химически инертен, можно кипятить. Можно задать необходимый размер пор и обеспечить свойства молекулярного сита. Высокая прозрачность. Легко готовить. Упругий, прочный.

На сегодняшний день - лучший носитель, но готовится из акриламида - ядовитого вещества.

1.1.4. Особенности электрофореза в полиакриламидном геле

Полиакриламидный гель (ПААГ) обладает многими качествами идеального носителя. Имея свойства молекулярного сита, он обеспечивает электрофоретическое разделение белковых смесей не только по заряду, но и по размеру и форме частиц. При электрофорезе в ПААГ крупные молекулы, размеры которых соизмеримы с диаметром пор геля, движутся медленнее, а мелкие молекулы свободно и быстро проходят через поры геля. ПААГ формируют путем сополимеризации акриламида, создающего линейную основу, и N,N′-метиленбисакриламида (BIS), служащего для поперечных «сшивок» линейных цепей.

В результате сополимеризации образуется трехмерная сетка геля. Каждый второй углеродный атом линейной цепи содержит кислотную амидную группу (рис. 3), что обеспечивает гидрофильность полимера. В то же время ПААГ не содержит ионизируемых групп. Для сополимеризации нужны инициаторы и катализаторы (окислительно-восстановительные системы – источники свободных радикалов). Чаще всего используют систему из двух компонентов:

  • персульфат аммония (ПСА, APS). Синоним - надсернокислый аммоний. Функция: инициатор полимеризации
  • N,N,N’,N’-тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД, TEMED). Функция: катализатор образования ПААГ

Рисунок 3 - Реакция полимеризации полиакриламидного геля

Меняя концентрацию акриламида от 2 до 50% можно задать определенную пористость геля. Например, диаметр пор в геле, содержащем 7.5% акриламида, равен 5 нм, а 30% акриламида - 2 нм. При выборе концентрации геля учитывают среднюю молекулярную массу (Mr) разделяемых веществ и форму их молекул. Отнеситесь к этому факту внимательно! Если плотность геля не будет соответствовать молекулярной массе исследуемого белка, то он, либо не войдет в гель, либо будет мигрировать с очень высокой скоростью и, как следствие, выйдет из геля раньше времени. Также в качестве параметров, влияющих на эффективность разделения, в особенности белков с приблизительно равной молекулярной массой, можно отметить время проведения электрофореза, длину разгоночной дистанции (чем больше гель, тем выше разрешение), температура процесса (при пониженной температуре белковые зоны меньше размываются за счет диффузии).

Таблица 2 - Выбор концентрации акриламида для оптимального разрешения смеси белков

Концентрация акриламида, %

Линейный диапазон распределения, кДа

15

12 – 43

10

16 – 68

7.5

36 – 94

5

57 – 212


В случае, когда требуется фракционировать белки исключительно по молекулярной массе, применяют ПААГ-электрофорез в денатурирующих условиях. Такая система была разработана в 1970 году Лэммли (англ. Laemmli) для изучения процесса сборки капсида четного бактериофага Т4. Для этого перед нанесением на гель образцы кипятили в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН, SDS) и 2-меркаптоэтанола. Под воздействием 2-меркаптоэтанола происходило восстановление дисульфидных связей, что предотвращало выпетливание денатурированных полипептидов и повышение их подвижности. SDS является сильным детергентом, его молекула состоит из двенадцатичленной алифатической неразветвленной цепи и ковалентно связанного с ним сульфат-иона, имеющего в растворе отрицательный заряд.



Рисунок 4 - Структура SDS

При использовании данного метода исходят из следующих допущений:

  • белки после обработки SDS находятся в полностью денатурированном состоянии;
  • количество молекул SDS, связанных с полипептидом, пропорционально его длине, и, следовательно, молекулярной массе;
  • собственный заряд полипептида несущественен по сравнению с суммарным отрицательным зарядом связанных с ним молекул SDS;
  • все полипептиды имеют одинаковый удельный заряд и разделяются обратно пропорционально логарифму их молекулярной массы. 

При более реалистичном рассмотрении вопроса, эффективность разделения зависит не от молекулярной массы белка, а от его молекулярного радиуса, так называемого радиуса Стокса. Действительно, многие белки имеют аномальную подвижность при проведении электрофореза, что зависит от множества факторов, в результате которых меняется удельный заряд, размер и форма комплексов «белок- SDS». Тем не менее, практика подтверждает верность данных допущений в подавляющем большинстве случаев.

Для проведения денатурирующего электрофореза в ПААГ используются различные буферные системы. Наиболее распространённая система, которая подразумевается по умолчанию — это буферная система Лэммли. Кроме того, в подавляющем числе работ используют, так называемый, disc-электрофорез (от англ. discontinous — разрывный) то есть используют гель, состоящий из двух частей:

  1. Формирующий (концентрирующий) гель имеет pH 6.8 и концентрацию полиакриламида от 2 до 8 %. Крупнопористый гель. Размер его пор ограничивает диффузию, но не обеспечивает гелю свойства молекулярного сита по отношению к большинству разделяемых белков. Этот гель нужен для электрохимического концентрирования белков пробы. Таким образом, концентрирующий гель собирает смесь белков перед переходом в разделяющий гель в одну узкую полосу.
  2. Разделяющий гель имеет рН 8.5 – 9 и концентрацию полиакриламида от 5 до 20 %. Это мелкопористый гель, в котором, собственно, и происходит электрофоретическое и молекулярно-ситовое разделение компонентов пробы.

Выбор плотности геля зависит от молекулярных масс исследуемых белков. Все буферы не содержат неорганических солей, основным переносчиком тока в них является глицин. При рН 6.8 суммарный заряд молекулы глицина близок к нулю. Вследствие этого для переноса определенного заряда (который определяется силой тока в электрофоретической ячейке), отрицательно заряженные комплексы полипептидов с SDS должны двигаться с большой скоростью. При рН 8.8 глицин приобретает отрицательный заряд, вследствие чего на границе концентрирующего и разделяющего гелей белки резко тормозятся. В переносе одинакового заряда через единицу площади теперь участвует гораздо больше заряженных молекул, следовательно, они двигаются с меньшей скоростью. Результатом этого является концентрирование белков на границе гелей, что очень сильно повышает разрешающую способность метода. В разделяющем геле белки мигрируют в зависимости от длины полипептидной цепи, то есть обратно пропорционально молекулярной массе.


1.1.5. Способы визуализации результатов (электрофореграмм)

Зоны разделившихся белков удобно анализировать, если их проявить, то естьсделать видимыми невооруженным глазом. Проявление осуществляют либо с целью обнаружения всех белков, либо только белков с определенной ферментативной активностью. В последнем случае получают зимограммы (энзимограммы). Иногда делят белки, заранее меченые хромофором (например, флуорескамином), и обнаруживают их по флуоресценции в УФ-области спектра с помощью специального оборудования. Используют также и радиоактивную метку (радиоактивным углеродом или йодом). Регистрацию полос в этом случае проводят методом авторадиографии с помощью рентгеновской пленки.

Для окрашивания белковых зон на ПААГ-электрофореграмме используют несколько универсальных методов. Для этого разделившиеся зоны белков фиксируют раствором уксусной кислоты (1 – 10%), смесью уксусной кислоты и этанола (реже – метанола), раствором ТХУ, насыщенным раствором сульфата аммония и окрашивают, используя раствор красителя. Фиксация предотвращает размывание зон из-за диффузии белковых молекул в геле. Используют такие красители, как амидочерный (амидошварц), кумасси ярко-синий (марок G250, R250), Zn/имидазол, нитрат серебра. Окраска полос происходит пропорционально количеству белка в зоне. Окраска и количество полос, соответствующих белкам, также зависят от чувствительности того или иного красителя. Так, нитрат серебра выявляет зоны с меньшим содержанием белка, чем кумасси.

Чрезвычайно высокой чувствительностью отличаются методы окраски белковых полос при помощи Zn/имидазола и солей серебра. Проявление с помощью Zn/имидазола состоит в последовательной обработке геля растворами 0.2 М имидазола и 0.3 М ZnCl2 в очень чистой дистиллированной воде, полученной с применением ионообменной хроматографии и очистки на мембранных фильтрах (дистиллят milliQ). Сочетание этих реактивов позволяет выявить 30 – 100 нг белка на полосу. Окрашивание с использованием нитрата серебра приближается по чувствительности к авторадиографии.

В настоящее время самым удобным и широко используемым является краситель кумасси ярко-синий, или бриллиантовый синий («Coomassie brilliant blue», он же ксилоловый яркий цианин), выпускаемый в двух модификациях: R-250 и G-250. Обе модификации кумасси плохо растворимы в воде и разбавленных кислотах, причем G-250 растворяется хуже, чем R-250. Повышению растворимости способствует добавление в раствор кумасси метанола, изопропанола или других спиртов. Не растворившиеся примеси следует отфильтровать. По сравнению с другими красителями кумасси ярко-синий имеет следующие преимущества:

  • его чувствительность выше, чем у амидочерного, и в большинстве случаев вполне подходит исследователям, - зависимость интенсивности окраски от концентрации белка остается линейной в более широком диапазоне концентраций,
  • кумасси значительно дешевле и проще в использовании, чем нитрат серебра и не требует особо чистой дистиллированной воды, как Zn/имидазол
  • в отличие от гелей, окрашенных Zn/имидазолом, гели при использовании кумасси можно хранить (либо высушить, либо поместить в 5%-ную уксусную кислоту, где существенного снижения интенсивности окраски полос не произойдет в течение 8-11 недель).

К недостаткам метода относится более низкая чувствительность, а также длительность процедуры отмывки геля от избытка связавшегося красителя. Для этих целей существуют модифицированные протоколы, например, окрашивание полиакриламидных гелей «коллоидным раствором кумасси». Также кумасси G250 используется для спектрофотометрического определения концентрации белков по методу Бредфорд.


1.2. Методическая часть лабораторной работы 

Таким образом, целью лабораторного занятия является знакомство с методикой анализа белков при помощи электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (возможные варианты сокращений, наиболее часто встречающихся в литературе: ДСН‑ПААГ, SDS‑ПААГ, SDS‑PAGE).

Для реализации поставленной цели необходимо:

  • приготовить полиакриламидный гель, применимый для разделения белков с соответствующей молекулярной массой;
  •  приготовить образцы для электрофореза;
  • приготовить электродный буферный раствор;
  • провести электрофоретическое разделение исследуемых образцов;
  • окрасить гель при помощи раствора кумасси ярко-синего;
  • получить электрофореграмму и проанализировать полученные результаты.

Техника безопасности

Лабораторное занятие проводится при строгом соблюдении правил безопасности при работе в химической лаборатории и эксплуатации электроприборов.


1.2.1. Расходные материалы и оборудование:

  1. Камера для вертикального электрофореза белков «MiniProtean Tetra» (Bio-Rad, США или аналог);
  2. Источник тока «Эльф-8» (ДНК-технология, Россия или аналог);
  3. Система гель-документирования с функцией детекции в видимой области светового излучения (UVP, США или аналог);
  4. Электронные аналитические весы (Shimadzu, Япония или аналог) и набор шпателей для взвешивания;
  5. Система для получения деионизированной воды milliQ (Millipore, США или аналог);
  6. Термостат «Гном» (ДНК-технология, Россия или аналог);
  7. Комплект оборудования для формирования геля (Bio-Rad, США или аналог);
  8. Настольная центрифуга (Eppendorf, Германия или аналог);
  9. рН-метр (Аквилон, Россия или аналог);
  10. Холодильник (Стинол, Россия или аналог);
  11. Шейкер (ELMI, Латвия или аналог);
  12. Набор автоматических пипеток (Sartorius, Швейцария или аналог);
  13. Магнитная мешалка с нагревом (Heidolph Instruments, Германия или аналог) ;
  14. Набором магнитов для мешалки (Heidolph Instruments, Германия или аналог);
  15. Химические стаканы (Simax, Чехия или аналог);
  16. Пластиковые пробирки на 1.5, 5 и 50 мл (Corning или аналог);
  17. Мерные колбы на 50, 100 и 1000мл (Simax, Чехия или аналог);
  18. Мерные цилиндры (50 и 100мл) и мерные стеклянные стаканы (Simax, Чехия или аналог);
  19. Стеклянные бутыли для хранения растворов (Simax, Чехия или аналог);
  20. Фильтровальная бумага, парафильм;
  21. Носики для автоматических пипеток (Corning или аналог);
  22. Носики для автоматической пипетки для нанесения образцов в гель (Corning или аналог), либо шприц многоразовый на 25 мкл (Hamilton, Швейцария или аналог)

1.2.2 Реактивы:

акриламид, N,N' –метиленбисакриламид, Трис, додецилсульфат натрия (SDS), персульфат аммония, N,N,N',N' – тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД), глицин, глицерин, β-меркаптоэтанол, ЭДТА, бромфеноловый синий, кумасси R250 (Bio-Rad, США или аналог), набор маркеров молекулярных масс белков (15-150 кДа) (Thermo Scientific или аналог), уксусная кислота, соляная кислота (х.ч), этанол.


1.2.3. Прописи для приготовления требуемых растворов:

 

1% раствор бромфенолового синего

Способ приготовления: Навеску бромфенолового синего растворить в воде MilliQ, довести объем раствора до метки. Хранить при комнатной температуре.

Лабораторная пропись для получения 10 мл раствора: 0.1г бромфенолового синего, деионизированная вода.


30%-ный раствор бис-акриламида

Состав:1% BIS, 29% акриламид, деионизированная вода.

Способ приготовления: Соответствующие навески веществ растворить в воде MilliQ, довести объем раствора до метки. Добавить активированный уголь и оставить для перемешивания на ночь на магнитной мешалке. Профильтровать и хранить при 4 0С.

Лабораторная пропись для получения 100 мл раствора: 1г BIS, 29г акриламида, деионизированная вода.


10%-ный раствор персульфата аммония

Состав: персульфат аммония, деионизированная вода.

Способ приготовления: Навеску персульфата аммония растворить в деионизированной воде MilliQ, довести объем раствора до метки. Хранить при ‑200С.

Лабораторная пропись для получения 5 мл раствора:0.5г персульфата аммония, деионизированная вода.


10%-ная уксусная кислота

Состав: «ледяная» уксусная кислота, деионизированная вода.

Способ приготовления: Разбавить «ледяную» уксусную кислоту водой MilliQ в соотношении 1:9. Хранить при комнатной температуре.

Лабораторная пропись для получения 100мл раствора: 10мл «ледяной» уксусной кислоты, 90 мл деионизированной воды.


Буферный раствор TES для приготовления образцов

Состав: 2% SDS, 100 мМ трис-HCl, pH 8.0, 10 мМ ЭДТА, деионизированная вода.

Способ приготовления: Смешать компоненты раствора и довести объем раствора до метки водой MilliQ. Довести рН до 8.0 при помощи соляной кислоты. Отфильтровать и хранить при комнатной температуре.

Лабораторная пропись для получения 50 мл раствора: 10 мл 10%-ного раствора SDS, 5 мл 1М раствора трис, 1 мл 0.5 М раствора ЭДТА, соляная кислота, деионизированная вода.


Буферный раствор 1 М трис-HCl, рН 6.8

Состав: 1М Tрис, соляная кислота, деионизированная вода.

Способ приготовления: Растворить навеску трис в деионизированной воде MilliQ. Довести рН до значения 6.8 при помощи соляной кислоты. Довести объем раствора до метки, отфильтровать и хранить при температуре +4 0С.

Лабораторная пропись для получения 100 мл раствора: 12.13 г трис, соляная кислота, деионизированная вода.


Буферный раствор 1 М трис-HCl, рН 8.8

Состав: 1М Tрис, соляная кислота, деионизированная вода.

Способ приготовления: Растворить навеску трис в деионизированной воде MilliQ. Довести рН до значения 8.8 при помощи соляной кислоты. Довести объем раствора до метки, отфильтровать и хранить при температуре +4 0С.

Лабораторная пропись для получения 100 мл раствора: 12.13 г трис, соляная кислота, деионизированная вода.

 

Окрашивающий раствор для геля:

Состав: 5% CH3COOH, 45% C2H5OH, 0.25% Coomassie R-250, деионизированная вода.

Способ приготовления: Смешать соответствующее количество уксусной кислоты и этилового спирта, довести объем раствора до метки водой MilliQ, добавить сухой краситель сoomassie R-250. Хранить при комнатной температуре. Окрашивающая способность сохраняется на 15 – 20 использований.

Лабораторная пропись для получения 100 мл раствора: 50мл 10%-ной CH3COOH, 45мл 96%-ного C2H5OH, 0.25 г сoomassie R250.

 

Окрашивающий раствор для образцов (Лэммли буфер)

Состав: 62.5 мМ трис-HCl, pH 6.8, 5% β -меркаптоэтанол, 10% глицерин, 2% SDS(10%), до 0.2% бромфенолового синего, деионизированная вода.

Способ приготовления: Смешать все компоненты раствора в указанном количестве.

Лабораторная пропись для получения 8.5 мл раствора: 0.5 мл 1М трис–HCl, pH 6.8, 0.4 мл β-меркаптоэтанола, 0.8 мл (1 г) глицерина, 1.6 мл 10%-ного раствора SDS, 0.2 мл 1%-ного раствора бромфенолового синего, 4.8 мл деионизированной воды.

 

Tрис-глициновый стоковый раствор 10Х:

Состав: 250 мМ трис, 1.92 М глицин, деионизированная вода.

Способ приготовления: Растворить навески трис и глицина в деионизированной воде MilliQ, довести объем до 1 л водой. Значение рН результирующего раствора должен быть в районе 8.3. Ни в коем случае нельзя подводить рН буфера до требуемого значения! Следует переделать его! Профильтровать через фильтр с диаметром пор 0.65 мкм.

Лабораторная пропись для получения 1л раствора: 30.25г трис, 144г глицина, деионизированная вода.


Tрис-глициновый электродный буферный раствор 1Х

Состав: 25 мМ трис, 192 мМ глицин, 0.1% SDS, деионизированная вода.

Для приготовления электрофорезного буфера развести в десять раз трис-глициновый стоковый раствор в мерной колбе и добавить SDS до конечной концентрации 0.1%. Довести деионизированной водой до требуемого объема.

Лабораторная пропись для получения 1л раствора: 100 мл трис-глицинового стокового раствора 10Х, 10 мл 10%-ного SDS, деионизированная вода.


Разделяющий гель:

Состав: 62.5 мМ трис-НСl, рН 8.8, 46.5% бис-акриламид (30%, 29:1), 0.1% SDS, 0.5% персульфата аммония, 0.09% TEMED, деионизированная вода.

Способ приготовления: Смешать все компоненты геля в указанном количестве

Лабораторная пропись для получения 1 геля: 0.74 мл деионизированной воды, 1.50 мл 1М трис-НСl, рН 8.8, 2.00 мл раствора бис-акриламида (30%, 29:1), 40 мкл 10%-ного раствора SDS, 20 мкл 10%-ного раствора персульфата аммония, 4 мкл TEMED .

 

Формирующий (концентрирующий) гель:

Состав: 62.5 мМ трис-НСl, рН 6.8, 26.85% бис-акриламид (30%), 0.1 % SDS, 0.94% персульфата аммония, 0.2% TEMED, деионизированная вода.

Способ приготовления: Смешать все компоненты геля в указанном количестве

Лабораторная пропись для получения 1 геля: 0.8 мл деионизированной воды, 0.25 мл 1М Трис-НСl, рН 6.8, 0.4 мл раствора бис-акриламида (30%, 29:1), 20 мкл 10%-ного раствора SDS, 14 мкл 10%-ного раствора APS, 3 мкл TEMED

 

1.2.4. Ход работы:

 

Для выполнения данной лабораторной работы рекомендуется использовать гребенки с 10 ячейками и спейсеры толщиной 0.75 мм. Ширина каждой ячейки – 6.5 мм. Максимальный объем образца – 30 мкл.

  1. В качестве подготовки к лабораторной работе стеклянные пластины промывают мягким детергентом, ополаскивают достаточным объемом деионизированной воды и спирта, затем высушивают в вертикальном положении.
  2. Рамку для заливки геля ставят в вертикальное положение зажимами вперед в открытом положении, затем собирают форму для геля – одно стекло – с приклеенным спейсером, второе – укороченное.
  3. Форму берут таким образом, чтобы метки («up») на стекле со спейсером находились вверху и укороченное стекло ‑ спереди, и устанавливают в рамку для заливки геля. Следует убедиться, что нижние края обоих стекол находятся на одном уровне, после чего необходимо зафиксировать форму зажимами.
  4. Собранную рамку устанавливают в стенд для заливки геля стеклянной формой вперед: упираясь нижним краем стекол в резиновую прокладку, подводят верхний край стекол под выступ на клипсе.
  5. Затем вставляют гребенки между стекол: надписями вперед, пока выступ на гребенке не упрется в укороченное стекло. От дна ячеек отмеряют 1 см и отмечают это положение фломастером. Удаляют гребенку.
  6. До этого уровня будет заливать разделяющий гель. После заливки разделяющего геля поверх него наслаивают 96% этиловый спирт. Как только разделяющий гель заполимеризовался (это занимает примерно полчаса), спирт тщательно удаляют при помощи фильтровальной бумаги.
  7. Заливают формирующий гель и устанавливают гребенку. Дают гелю полимеризоваться (это занимает примерно полчаса), и достают рамку из стенда для заливки геля.
  8. Повернув защелки вперед, извлекают кассету с гелем, вставляют в щели на дне электродной ячейки (укороченное стекло смотрит внутрь) и прижимают к зеленой прокладке. Следует убедиться, что укороченное стекло попадает в углубления на зеленой прокладке.
  9. Вставляют кассеты с гелем и электродную ячейку в фиксирующую рамку. Надавливая сверху на электродную ячейку, защелкивают оба зажима на фиксирующей рамке, и опускают фиксирующую рамку в мини-резервуар.
  10. Внутреннюю камеру заполняют трис-глициновым электродным буферным раствором так, чтобы его уровень располагался между верхними краями укороченного стекла и стекла со спейсером (для этого необходимо примерно 125 мл буфера) и добавляют примерно 200 мл трис-глицинового буфера в мини-резервуар.
  11. Готовят образцы для электрофореза.

    Приготовление образцов из телец включения, клеточной биомассы, нерастворимой фракции:
    Центрифугируют 100 мкл образца при 7000 g в течении 10 минут, тщательно удаляют полностью супернатант, затем добавляют к пробе 100 мкл горячего буфера TES и прогревают образец в течение 5 минут при 99 0С. После чего добавляют к пробе 100 мкл буфера Лэммли и снова прогревают образцы 5 минут при 990 С.

    Приготовление растворимых белковых образцов:
    Отбирают 100 мкл образца и добавляют к нему 100 мкл буфера Лэммли. Прогревают образцы в течение 5 минут при 99 0С.
    Маркер молекулярных весов поставляется уже в готовом состоянии. Его необходимо только прогреть в течение 5 минут при 99 0С.
  12. Наносят образцы в ячейки геля при помощи мини-шприца Гамильтона или дозатора с тонким носиком.
  13. Электрофорез проводят при постоянном напряжении 200 В. Время электрофореза - примерно один час.
  14. По окончании электрофореза отсоединяют ячейку Mini-Protean III от источника напряжения. Снимают крышку и осторожно достают фиксирующую рамку с электродной ячейкой и кассетами для геля, после чего сливают электрофорезный буферный раствор, открывают защелки фиксирующей рамки и достают электродную ячейку с кассетами для гелей.
  15. Специальным шпателем разъединяют стеклянную форму для геля. Гель погружают в фиксирующий раствор (10%-ная уксусная кислота) и, осторожно покачивая, отсоединяют его от стекла.
  16. Фиксируют гель в течение 30 мин при постоянном покачивании, после чего заливают его окрашивающим раствором. Для ускорения процесса окрашивания можно подогреть окрашивающий раствор вместе с гелем в микроволновой печи.
  17. Когда интенсивность полос на геле перестает меняться, окрашивающий раствор необходимо слить, а гель промыть раствором 10%-ой уксусной кислоты. Раствор для отмывки также можно подогреть вместе с гелем в микроволновой печи. Это существенно ускоряет процесс отмывки.
  18. Результаты электрофореза визуально анализируют по электрофореграмме, путем сравнения со стандартными образцами и маркером молекулярных весов.

 

1.3. Вопросы для подготовки к вебинару

 

  1.  Какое свойство белковых молекул позволяет им образовывать отдельные зоны на электрофореграмме? От каких условий это свойство зависит и может изменяться?
  2. Что такое суммарный заряд белковой молекулы? Почему он изменяется при изменении рН окружающей среды? Что такое pI?
  3. Как будет изменяться суммарный заряд белковых молекул при проведении электрофореза в нативных и денатурирующих (SDS) условиях?
  4. Почему не следует выбирать электродные буферные растворы со значением рН, значительно (более чем на 4 ед.) отличающимся от рI разделяемых белков?
  5. Напишите структурную формулу полиакриламидного геля. Почему ПААГ считается лучшим носителем жидкой фазы?
  6. Объясните использование следующих компонентов для приготовления геля: персульфат аммония, акриламид, N,N′-метиленбисакриламид, додецилсульфат натрия, трис?
  7. Объясните использование следующих компонентов для приготовления буфера Лэммли: трис, β-меркаптоэтанол, додецилсульфат натрия, глицерин, метиленовый синий?
  8. Как можно повысить разрешающую способность электрофореза для более эффективного разделения препарата, состоящего из белков со следующими значениями молекулярной массы: 10 кДа, 18 кДа, 30 кДа, 32 кДа, 36 кДа, 48 кДа, 79 кДа, 112 кДа, 220 кДа?

 

1.4. Список литературы

 

  1.  «Protein electrophoresis», GE Healthcare Biosciences resources (http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/ru/GELifeSciences/applications/electrophoresis/ );
  2. U. K. Laemmli. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature, 227, 680-685.
  3. H. Schagger, G. von Jagow. 1987. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa // Anal. Biochem., 166, 368-379.
  4. Э. Гааль, Г. Медбеши, Л. Верецкеи Электрофорез в разделении биологических макромолекул. М.: Мир, 1982. – 448 с.
  5. Камышников В.С. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике (в 2-х томах). Минск, 2000. – 463 с.
  6. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие). М.: Наука, 1981. – 288 с.
  7. Д. Нельсон, М. Кокс. Основы биохимии Ленинджера. Том 1. М.: Бином, 2012. – 696 стр.
  8. К. Уилсон, Д. Уолкер. Принципы и методы биохимии и молекулярной биологии. М.: Бином. Лаборатория знаний, 2013. – 848 с.
  9. П. Ригетти. Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение. М.: Мир.1986. – 399 с.

Последнее изменение: Среда, 6 ноября 2019, 17:30