Современные методы бионанотехнологии. Демонстрационный

Создание фосфодиэфирных связей в одноцепочечных разрывах двухцепочечной ДНК с помощью ДНК-лигаз является наряду с рестрикцией одним из важнейших этапов получения рекомбинантных ДНК in vitro. Наибольшее применение в генно-инженерных исследованиях находит ДНК-лигаза бактериофага Т4. Реакция лигирования протекает в два этапа (рис. II.3). Вначале образуется промежуточный комплекс фермент–АМР (этап 1), после чего остаток АМР переносится на 5’-фосфатную группу концевого нуклеотида в точке разрыва ДНК (этап 2). Образовавшаяся фосфодиэфирная связь гидролизуется во время нуклеофильной атаки 3’-ОН группы соседнего нуклеотида, что приводит к образованию новой фосфодиэфирной связи, восстанавливающей целостность сахаро-фосфатного остова ДНК. Т4-ДНК-лигаза осуществляет соединение фрагментов двухцепочечной ДНК, обладающих комплементарными "липкими" или "тупыми" концами. Как следует из механизма реакции, необходимым условием протекания лигирования является наличие 5’-концевого фосфата и 3'-концевого гидроксила в точках разрыва цепей ДНК. При этом эффективность соединения фрагментов ДНК по "тупым" концам Т4-ДНК-лигазой возрастает в присутствии Т4-РНК-лигазы, которая осуществляет ковалентное соединение 5’-фосфорилированных концов одноцепочечных ДНК или РНК с 3’-ОН группами одноцепочечных нуклеиновых кислот.

Ферменты матричного синтеза ДНК и РНК

К ферментам матричного синтеза нуклеиновых кислот относятся многочисленные ДНК- и РНК-зависимые ДНК- и РНК-полимеразы, осуществляющие зависимый от матричных ДНК или РНК синтез нуклеиновых кислот. Эти ферменты обычно используются в генной инженерии для получения двухцепочечных молекул ДНК из одноцепочечных, а также для обратной транскрипции, т.е. синтеза двухцепочечных ДНК, комплементарных мРНК, которые называют комплементарными ДНК (кДНК).

При проведении лигазной цепной реакции (ЛЦР, LCR - ligase chain reaction ) используется способность ДНК- лигаз восстанавливать фосфодиэфирные связи в одноцепочечных разрывах двухцепочечных молекул ДНК. Для этого синтезируют два олигонуклеотида, комплементарные непрерывной последовательности нуклеотидов ДНК, которые после гибридизации с такой последовательностью примыкают друг к другу и разделены лишь одноцепочечным разрывом. При этом 3'-конец предшествующего нуклеотида должен содержать свободную 3'-ОН-группу, а в 5'- положении 5'-конца олигонуклеотида, следующего за ним, должна находиться фосфатная группа.

Механизм лигирования ДНК Т4-ДНК-лигазой

1 – образование промежуточного комплекса фермент Е–AMP; 2 – образование фосфодиэфирной связи

В первом цикле ЛЦР эти два олигонуклеотида отжигаются с исследуемой денатурированной ДНК (как и при ПЦР) в присутствии термостабильной ДНК-лигазы. Реакционную смесь прогревают до температуры, оптимальной для лигирования, после чего между отожженными олигонуклеотидами образуется фосфодиэфирная связь. Затем температуру реакционной смеси повышают до температуры плавления гибрида.

Во втором цикле температуру реакционной смеси понижают до температуры отжига олигонуклеотидов, которые, находясь в молярном избытке по отношению к освободившимся продуктам реакции, преимущественно гибридизуются с анализируемой ДНК. Далее связавшиеся олигонуклеотиды снова лигируют, и образовавшийся продукт реакции освобождают из гибрида повышением температуры. При этом содержание продукта в реакционной смеси удваивается.

После проведения n циклов ЛЦР в реакционной смеси теоретически может оказаться nx молекул продукта реакции, где х - число пар олигонуклеотидов, вступающих в реакцию в каждом цикле, теоретически равное числу копий анализируемой последовательности нуклеотидов в реакционной смеси.

ЛЦР не происходит, если 3'-концевой нуклеотид первого олигонуклеотида или 5'-концевой нуклеотид второго некомплементарны соответствующим нуклеотидам анализируемой ДНК. Поэтому при наличии мутации в тех сайтах ДНК, где олигонуклеотиды стыкуются друг с другом, в реакцию со своим партнером вступает только измененный олигонуклеотид, полностью комплементарный анализируемой мутантной ДНК, т.е. продукт реакции образуется лишь при наличии в реакционной смеси "мутантного" олигонуклеотида, но не олигонуклеотида дикого типа.

Принципы, лежащие в основе метода определения мутаций с помощью ЛЦР, сходны с принципами аллель-специфической ПЦР .

Для количественной оценки ЛЦР один из олигонуклеотидов обычно метят биотином, а другой (соответствующий мутантному аллелю) - радиоактивной или флуоресцентной меткой. По завершении ЛЦР олигонуклеотиды, меченные биотином, связывают с мембранными фильтрами с иммобилизованным стрептавидином, а количество лигированных олигонуклеотидов определяют по количеству связавшейся с фильтрами радиоактивной или флуоресцентной метки после отмывки непрореагировавших олигонуклеотидов.

Лигирование фрагментов ДНК. Особенности лигирования по тупым и липким концам. Проблемы, возникающие при лигировании по тупым концам. Адаптеры и линкеры. Расчет лигазной смеси для проведения реакции. Оптимальные условия проведения реакции in vitro. Методы повышения эффективности лигирования. Полинуклеотид киназы. Полинуклеотид киназа фага T4, как основной фермент для фосфолирирования 5’-концов ДНК. Определение единицы активности ПНК.

Лигазная реакция – это реакция образования фосфодиэфирной связи между 5' и 3’рестрицированными концами ДНК под действием ферментов лигаз. Наиболее широко используемой в генной инженерии лигазой является Т4-ДНК-лигаза - лигаза, выделенная из бактериофага Т4. Кофакторами лигазной реакции являются ионы Mg ²⁺ и  ATP. Реакционный буфер для лигазной реакции (он и в этом случае продается вместе с ферментом) включает в себя 10 мМ трис-HCl pH 7.5, 0.5 мМ ATP, 10 мМ MgCl₂, 10 мМ DTT. В случае «липких» концов лигазную реакцию проводят в течение 0.5 - 1 часа при комнатной температуре ( в среднем 25⁰С) или при +10 – 14⁰С в течение ночи. В случае «тупых» концов лигазная реакция проходит в 50 раз хуже, чем в случае липких, поэтому ее проводят при +14⁰С в течение ночи и в этом случае в реакцию вносят большее количество фермента.

Эффективность протекания лигазной реакции можно улучшить в несколько раз, добавив в лигазную смесь 5 % PEG. После прохождения лигазной реакции, фермент обычно инактивируют нагреванием при 65⁰С в течение 10 минут. Количество рестрицированного вектора, вносимого в лигазную реакцию, как правило, составляет от 20 до 30 нг. Молярное соотношение встраиваемого фрагмента по отношению к вектору должно быть 5 к 1, в случае лигирования по «липким» концам, и 10 к 1, в случае лигирования по «тупым» концам. Количество фермента, вносимого в реакцию, обычно составляет от 1 до 10 единиц. Следует заметить, что и в этом случае все реагенты необходимо хранить на льду, а для внесения компонентов использовать стерильные носики.

Контроли лигазной реакции. При проведении лигазной реакции необходимо поставить несколько контрольных проб на полноту прохождения предшествующей ей рестриктной реакции. Содержимое этих проб трансформируют вместе с содержимым опытной пробы, и по соотношению количества колоний, выросших на опытных и контрольных чашках, оценивают результат. Это, впоследствии, сильно облегчает интерпретацию полученных результатов лигирования, а также анализ полученных колоний. Контроль № 1 – это контроль на недорестрикцию вектора двумя используемыми рестриктазами. Эта проба содержит только буфер и рестрицированный вектор. Контроль № 2 – это контроль на недорестрикцию вектора хотя бы одной из используемых рестриктаз. В состав этой пробы входит буфер, рестрицированный вектор и T4-ДНК-лигаза.

Лигирование ДНК

1.Смешать:         

20 нг фрагмента вектора,

N нг клонируемого фрагмента, 

1 мкл лигазного буфера (рибоАТФ),

1 мкл лигазы               

очищенной воды до 10 мкл.

2. Инкубировать при комнатной температуре в течение от 1 часа  до ночи.

Если в реакции лигирования используется дефосфорилированный векторный фрагмент, то молярное соотношение вектор/фрагмент должно составлять 2:1. Во всех остальных случаях – 1:2 – 1:10.

Особенности:

1. Т4 ДНК лигаза сильно ингибируется NaCl или KCl, если их концентрация превышает 200 мМ.
2. Полиэтиленгликоль (PEG) значительно ускоряет скорость лигирования ДНК с тупыми концами. Конечная концентрация PEG4000 в реакционной смеси должна составлять 5% (w/v) (B.H.Pheiffer, S.B.Zimmerman,1983, Nucleic Acids Res., 11, 7853-7871).
3. Следует проводить инактивацию Т4 ДНК лигазы перед трансформацией. Прогрев в течение 10 мин при 65°С может увеличить количество трансформантов, в некоторых случаях, на два порядка (B.K.Michelsen,1995, Anal. Biochem., 225, 172-174)

Лигирование также применяется для клонирования ДНК при помощи адаптеров.

Адаптеры – синтетические одно-двуцепочечные олигонуклеотиды, предназначенные для объединения молекул с несовместимыми концами.

Линкеры – пара однонитевых комплементарных друг другу олигонуклеотидов, которые образуют дуплексы с тупыми концами и содержат сайты рестрикции.

Другие ферменты, применяемые в генетической инженерии 

Полинуклеотидкиназа – фермент класса трансфераз, осуществляющий фосфорилирование свободных 5-ОН-концов молекул нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) или их фрагментов с использованием в качестве донора фосфатных групп АТФ или АДФ. Единица активности полинуклеотидкиназы  (единица Ричардсона) соответствует количеству  фермента, катализируемого присоединение 1 нмоль  [³²P]  в реакционном объеме 50 мкл за 30 минут при 37С к  5’-гидроксильным группам  ДНК спермы лосося.

Метод препаративного фосфолирирования нуклеотидов. Добавление радиоактивной метки ³²Р при помощи полинуклеотидкиназы. Применение ПНК при клонировании. Терминальная трансфераза. Определение единицы активности терминальной трансферазы. Коннекторы. Клонирование при помощи коннекторов

Препаративное фосфорилирование олигонуклеотидов.

1. Смешать:     
   20-40 пмолей ДНК 
   1 мкл 10 х PNK-буфер  
   2 мкл 5 мМ rATP
   1 мкл PNK (10 ед)
   воды очищенной до 10 мкл.
2. Инкубировать при 37°С в течение 1 часа
3. Ингибировать реакцию при 70°С  в течение 30 мин.

Для пересчета концентраций олигонуклеотидов используйте формулу:

C(мкМ, pmol/mkl) = 100 х OD / L, OD – количество оптических единиц в мл;

L – длина олигонуклеотида.

Пропись буфера 10 х PNK-буфер : 700 мМ Трис-НСl, 100 мМ MgCl₂, 50 мМ DTT

(pH 7.6 при 25°С).

Эффективность фосфорилирования олигонуклеотида зависит

в немалой степени от основания,  которое находится на его 5’-конце .

Эффективность фосфорилирования увеличивается в ряду:

G (60%)> A (45%) > T (45%) > C (10%).

Терминальная трансфераза (концевая дезоксинуклеотидилтрансфераза) была обнаружена Боллумом в 1962 году в тимусе теленка.

Субстратом терминальной трансферазы при использовании в качестве кофактора ионов Mg²⁺ является одноцепочечная ДНК с З'-ОН концом или двухцепочечная ДНК с выступающим одноцепочечным З'-ОН концом. Если в качестве кофактора используются Co ²⁺, этот фермент может катализировать присоединение дезоксинуклеотидов к 3’-ОН концу двухцепочечной ДНК с тупыми концами.

При введении в реакцию, направляемую терминальной трансферазой, лишь одного типа дезоксинуклеотидов образуются молекулы ДНК, имеющие гомополимерные 1-цепочечные 3'-концы. Таким же образом можно достроить другим молекулам ДНК гомополимерные 3'-концы, комплементарные первым. Смешение полученных препаратов ДНК при определенных условиях может приводить к формированию гибридных молекул ДНК.

Именно с помощью концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы в 1972 г. был выполнен первый эксперимент по рекомбинации молекул ДНК in vitro.

Поли (А) - полимераза E. coli была открыта Сиппелом в 1973 году. Она катализирует присоединение к 3’-ОН концу одноцепочечных молекул РНК поли (А) последовательностей. Применяется при подготовке молекул РНК к копированию с них комплементарной ДНК для введения радиоактивной метки в 3’-конец РНК. Терминальная трансфераза из тимуса теленка (терминальная дезоксирибонуклеотидилтрансфераза), осуществляющая последовательное присоединение дезоксирибонуклеозидмонофосфатов из пула дезоксирибонуклеозидтрифосфатов к 3’-OH-группам молекул ДНК, используется для введения радиоактивной метки в составе меченых нуклеотидов в 3’-концы ДНК, а также присоединения к 3’-концам фрагментов ДНК (особенно кДНК) протяженных гомополимерных последовательностей нуклеотидов (коннекторов) для последующего их клонирования.

Щелочные фосфатазы в генетической инженерии. Особенности щелочных фосфатаз CIAP, BAP, SAP. Определение единицы активности ЩФ. Применение фермента при клонировании и мечении фрагментов ДНК. Методика дефосфолирирования вектора. Термолабильные щелочные фосфатазы. Нуклеазы в генной инженерии. Экзонуклеазы: экзонуклеаза III E. coli, фага λ, Bal31. Эндонуклеазы: нуклеазы S1, Mung Bean, P1. ДНКазаI, РНКазы А и Н.

Щелочные фосфатазы бактерий (BAP) и кишечника теленка (CIAP) катализируют удаление 5’-фосфатных групп ДНК или РНК, а также расщепление макроэргических связей рибо- и дезоксирибонуклеозидтрифосфатов. Их используют при подготовке фрагментов нуклеиновых кислот к введению 5’-концевой радиоактивной метки ³²Р, а также для предотвращения лигирования векторных молекул ДНК самих на себя. Как уже упоминалось выше, ДНК-лигаза способна образовывать фосфодиэфирные связи в одноцепочечных разрывах лишь при наличии в них 5'-концевого фосфата. Удаление 5'-концевых фосфатных групп молекул вектора, лианеризованных с помощью одной рестриктазы во время его подготовки для клонирования соответствующего фрагмента ДНК, предотвращает образование кольцевых молекул вектора (без вставки), а также его олигомеров во время лигирования с клонируемой последовательностью. Необходимые для лигирования со вставкой фосфатные группы содержатся в самих клонируемых фрагментах ДНК, а остающиеся в результате неполного лигирования два одноцепочечных разрыва репарируются in vivo после введения вектора со вставкой в бактериальные клетки.

В заключение следует рассмотреть некоторые нуклеазы, часто используемые в генной инженерии. Нуклеазы – это гидролитические ферменты, расщепляющие нуклеиновые кислоты. По механизму расщепления субстратов нуклеазы разделяют на экзо- и эндонуклеазы. Экзонуклеазы осуществляют последовательное отщепление моно- или небольших олигонуклеотидов с концов молекул ДНК или РНК, тогда как эндонуклеазы вносят в молекулы нуклеиновых кислот внутренние разрывы. В частности, к эндонуклеазам относятся многочисленные рестриктазы, рассмотренные выше. Некоторые нуклеазы обладают более широкой специфичностью и могут гидролизовать как РНК, так и ДНК, а также одновременно проявлять эндо- и экзонуклеазную активности. Нуклеаза Bal31 из Alteramonias aspejiana последовательно отщепляет отдельные моно- и олигонуклеотиды с 5’- и 3’-концов двухцепочечных ДНК, укорачивая обе цепи ДНК приблизительно с равной скоростью. При этом нуклеаза Bal31 гидролизует и одноцепочечные ДНК.

Экзонуклеаза III E. coli катализирует последовательное отщепление 5’-нуклеотидов из двухцепочечных ДНК в направлении 3’®5’. Фермент обладает эндонуклеазной активностью по отношению к апуринизированной ДНК, активностью РНКазы H (гидролиз РНК в РНК-ДНК-гибридах) и 3’-фосфатазной активностью.

Экзонуклеаза фага l катализирует последовательное отщепление 5’-мононуклеотидов в двухцепочечных ДНК при наличии в них 5’-концевых фосфатных групп. Ее используют для получения одноцепочечных молекул ДНК с целью их последующего секвенирования.

Нуклеаза S1 из Aspergillus orizae специфически расщепляет одноцепочечные молекулы ДНК с образованием 5’-фосфорилированных моно- и олигонуклеотидов. Те же свойства присущи и нуклеазе золотистой фасоли (mung bean).

Панкреатическая рибонуклеаза A (РНКаза A) обладает активностью эндорибонуклеазы, специфически расщепляющей фосфодиэфирные связи, образованные пиримидиновыми нуклеотидами. Продуктами гидролиза являются 3’-фосфорилированные пиримидиновые мононуклеотиды и олигонуклеотиды, содержащие концевые пиримидин-3’-монофосфаты.

Панкреатическая дезоксирибонуклеаза I (ДНКаза I) представляет собой эндонуклеазу, гидролизующую как одно-, так и двухцепочечную ДНК с образованием сложной смеси моно- и олигонуклеотидов, содержащих 5’-фосфатные группы. В присутствии ионов Mg²⁺ ДНКаза I независимо атакует каждую цепь ДНК, при этом места разрывов располагаются статистически вдоль молекулы, а в присутствии ионов Mn²⁺ расщепляет обе цепи ДНК приблизительно напротив друг друга.

Обратные транскриптизы (ревертазы).Биологическая роль и функции ревертаз. Обратные транскриптазы в генетической инженерии: обратная транскриптаза вируса миелобластоза птиц и обратная транскриптаза вируса лейкоза мышей Молони. Проведение обратной транскрипции: особенности выделения РНК, праймеры для ОТ, праймер oligo-dT, условия проведения ОТ. Коммерческие наборы для проведения обратной транскрипции. Полимераза Tth. Топоизомераза I Vaccinia virus. Механизм клонирования TOPO (Invitrogen). ДНК-метилазы: типы и функции. Применение в генетической инженерии: сайт-направленный мутагенез

РНК-зависимые ДНК-полимеразы (обратные транскриптазы, ревертазы). Обратные транскриптазы способны осуществлять синтез ДНК на матрице РНК, полимеризуя четыре дезоксирибонуклеозидтрифосфата, как это имеет место в случае ДНК-зависимых ДНК-полимераз. Обратные транскриптазы, так же как и ДНК-полимеразы функционируют только при наличии затравки. Широко используемая в генной инженерии обратная транскриптаза вируса миелобластоза птиц помимо полимеризующей активности обладает 5’®3’- и 3’®5’-экзорибонуклеазными активностями и расщепляет РНК в ДНК-РНК-гибридах по процессивному механизму. Обратные транскриптазы находят применение в синтезе двухцепочечных ДНК, комплементарных РНК (особенно мРНК), для последующего ее клонирования в плазмидных векторах при получении библиотек (клонотек) кДНК. Обратные транскриптазы, подобно ДНК-полимеразам, могут быть использованы для введения радиоактивной или флуоресцентной метки в ДНК-зонды в составе соответствующим образом меченных дезоксирибонуклеозидтрифосфатов.

Недавно способность синтезировать ДНК на матрице РНК в определенных условиях была продемонстрирована для термостабильной ДНК-полимеразы Thermus thermophilus (Tth) . Это позволяет использовать ее для прямого обнаружения специфических РНК в биологических образцах методом ПЦР. Современные модификации такого подхода дают возможность в одной реакционной смеси (и пробирке) синтезировать в реакции обратной транскрипции небольшое число копий амплифицируемого фрагмента ДНК на матрице РНК, которые сразу же используются тем же ферментом в качестве матрицы в обычной ПЦР (one tube PCR).